肿瘤免疫：BiTEs和它的兄弟姐妹，bites

前言

利用T细胞的潜能，有针对性地识别和杀死癌细胞的策略，开创了癌症治疗的新纪元，并促进了广泛的肿瘤免疫疗法的发展。总的来说，三种基于T细胞的免疫疗法目前被批准用于癌症患者的常规临床应用：（1）免疫检查点抑制剂（ICIs）；（2）双特异性抗体；（3）转基因T细胞，特别是嵌合抗原受体（CAR）表达的T细胞。

ICIs是阻断T细胞激活负调节因子的单抗，如程序性细胞死亡1（PD－1）、程序性细胞死亡1配体1（PD－L1）或细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA－4），从而使已有的T细胞克隆恢复活力。尽管ICIs对越来越多的不同恶性肿瘤的治疗有效，但ICIs仅在某些癌症类型（最显著的是黑色素瘤）的患者中诱导长期缓解，并且仅在少数患者中。此外，肿瘤微环境（TME）中缺乏浸润性T细胞和／或大量免疫抑制因子可能进一步限制ICIs的疗效。由于ICIs的疗效完全或部分依赖于T细胞对肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性新抗原的固有MHC依赖性反应，双特异性抗体和CAR T细胞技术应运而生，用于将细胞毒性T细胞重定向到预定的肿瘤靶点，主要用于MHC非依赖性癌细胞清除。1995年，第一个BiTE，由两个靶向CD3和17－1A的单链抗体连接而成，也就是抗CD19×CD3的blinatumomab的前体。1998年，Blinatumomab在德国和瑞典进入了人类研究的第一个阶段，直到2004年，NHL患者才首次观察到blinatumomab有意义的临床反应，剂量为每天15?g／m2。几年后，blinatumomab被用于广泛的临床试验，直到最后通过FDA和EMA的批准。在随后的几年里，blinatumomab的治疗范围进一步拓宽，2018年，随着FDA批准其用于首次或第二次完全缓解后MRD≥0．1％的pre－B ALL患者群体的治疗，双抗领域经历了爆炸式增长，未来临床发展前景广阔。

BiTE的结构和作用机理

BiTEs，即以T细胞作为效应细胞的双特异性单链抗体，它是采用单链抗体技术，将两个不同抗体的重链及轻链可变区连接在一条多肽链上，并作为活性蛋白在CHO细胞中进行分泌表达。其基本的形式是VL1－linker－VH1－linker－VH2－linker－VL2。BiTEs具有两个抗原结合部位，可以同时和T细胞及癌细胞表面的抗原分子结合，从而有效地激活效应T细胞来达到杀伤病变细胞的目的。

BiTEs的四个不同的结构域可以有多种不同的排列方式，但不同的形式可能会影响BiTEs的亲和力及表达量。据报道，VH－linker－VL比VL－linker－VH的亲和力高10倍以上，但VL－linker－VH的表达量比VH－linker－VL高20倍。BiTEs完全没有亲代抗体的恒定区域，因此体积小（～55kDa）且高度灵活，使免疫效应细胞和癌细胞之间能够密切相互作用，从而促进与每个细胞上的靶抗原充分结合。

BiTEs通过在T细胞和肿瘤细胞之间提供一个物理连接，从而有效地激活静止的效应T细胞，介导靶细胞的裂解。BiTEs不受T细胞特异性受体和靶细胞上MHCⅠ类分子等的约束，不需要共刺激分子的参与。激活的T细胞释放细胞毒性，在靶细胞上面“打孔”，从而诱导细胞凋亡。经过一系列的反应后，病原细胞被杀死，而T细胞依然保持其活性进入下一轮的杀伤过程。

BiTE和CAR－T

BiTE和CAR－T细胞疗法之间有明显的相似性。和BiTEs一样，CAR－T细胞能够通过可变的TAA靶向抗原结合域（通常是单链抗体）识别肿瘤细胞。然而，与BiTEs激活不同的是，T细胞不是通过内源性TCR复合物激活的，而是通过来自CD3和共刺激分子（如4－1BB和CD28）的细胞内信号转导域激活的，这些区域被整合到一个合成的细胞表面受体中，细胞外部分含有单链抗体（即CAR）。因此，用CAR结构转导患者的T细胞会导致这些效应细胞针对选定的靶TAA重新定向，从而发挥对肿瘤细胞的杀伤。与BiTE的生产不同，CAR－T细胞制造需要体外基因修饰和细胞扩增，特别是自体T细胞，这是一个相对低效、资源密集、耗时且成本高昂的过程。

T细胞与靶细胞之间免疫突触的形成，细胞的连续杀伤能力，以及细胞溶解蛋白如穿孔素和颗粒酶的定向释放，是CAR－T细胞和BiTEs共同的作用模式特征。此外，BiTEs和CAR－T细胞都是通过CD8＋T细胞和CD4＋T细胞发挥其效应功能。然而，体外和体内研究表明，来自低分化和未接触抗原的T细胞亚群，如干细胞记忆T细胞（Tscm）或中心记忆T细胞（Tcm）的CAR－T细胞具有优越的抗肿瘤活性、增强的扩增能力和持久的存活期，而BiTE介导靶细胞死亡主要通过抗原经历的T细胞在激活后分化为效应记忆T（Tem）细胞。

CiTEs，SMITEs和TriKEs

双功能检查点抑制性T细胞接合器（CiTEs）的开发已取得实质性进展，这个结构将局部限制性免疫检查点抑制功能与BiTEs的T细胞重定向功能结合在一个分子中。CiTEs将PD－1／PD－L1的抑制性功能局限在靶向TAA相互作用的重定向T细胞局部，因此，该分子BiTE部分的功效得到增强，同时避免了与抗PD－1或抗PD－L1 ICI相关的T细胞的全身活化，从而限制了与免疫有关的不良事件的风险。

这种新型T细胞接合器的概念证明已在AML的临床前模型中得到验证。基于类似的机制，Horn等人已经开发出一种抗PD－L1–CD3的BiTE，它同时将内源性T细胞和NKT细胞重新定位到PD－L1＋细胞。临床前研究表明，当与其他不能中和PD－1／PD－L1介导的免疫抑制的免疫疗法联合使用时，这种形式的CiTE可能对PD－L1表达的实体瘤患者有效。

同时多重相互作用BiTE（SMITEs）是另一种创新的T细胞参与治疗形式。SMITEs由两个单独的BiTE组成，每一个都针对不同的抗原，其中一个以CD3为靶点，在与靶TAA结合时诱导TCR信号，而另一个靶向CD28以提供T细胞共刺激信号。例如，含有抗PD－L1–CD28 BiTE的SMITEs可通过CD28与T细胞的结合将抑制性PD－L1信号转化为正向的共刺激信号，这些T细胞通过第二个TAA特异性和CD3靶向的BiTE进一步潜在地共同激活。SMITEs可以在任何一种BiTE的最低活性浓度甚至更低的浓度下，依然发挥有效作用。SMITE平台不仅提供了克服由免疫检查点蛋白介导的抵抗机制的机会，而且还可以靶向更广泛的细胞表面TAA，以提高肿瘤的特异性，同时限制免疫逃逸的风险。

增强效应细胞细胞毒性的另外一种形式是三特异性杀伤接合器（TriKEs），其主要目的是利用NK细胞对抗癌细胞的活性，并包含与免疫刺激细胞因子相连的双特异性抗体。一种抗CD33－CD16／IL－15的TriKE能将NK细胞定向到髓系母细胞，目前正在AML患者中进行临床研究（NCT03214666）。

其它形式的T细胞接合器

改变“典型”BiTE的结构可以提供多种新的治疗方法。例如，新的双亲和力再靶向蛋白（DART）已经被开发出来，它们具有比BiTEs更有利的结构和生物学特性，包括更大的稳定性和将T细胞毒性靶向恶性细胞的最佳重定向。DART分子是由提供双重抗原结合位点的两个Fv链组成的双特异性diabody，通过二硫键和非共价键组装，从而提高稳定性并限制链内域相互作用。

DARTs的结构使目标和效应细胞之间的最佳交互作用成为可能，从而产生高水平的靶细胞杀伤。在临床前模型相比，DARTs比BiTEs表现出更好的细胞毒性。在临床前模型中，DART分子已成功应用于NK细胞或T细胞对恶性B细胞的再靶向（抗CD16–CD32B DART或抗CD19–CD3 DART duvortuxizumab，也称为MGD011）和T细胞向CD123＋AML细胞的再靶向（flotetuzumab；MGD006）或糖蛋白A33表达的胃肠道癌细胞（gpA33；MGD007）；这些药物大多已进入临床开发阶段（NCT02454270、NCT02152956、NCT03739606、NCT02248805和NCT03531632）。

重要的是，DART分子可被设计成包含Fc结构域（例如，duvortuxizumab、gpA33和PRS－343），其半衰期更长，因此有助于使用更方便的间歇给药，而不是连续输注。

传统的BiTEs是对称设计的，CD3和TAA为1：1，通过1：2设计增加结合能力可能提高对肿瘤细胞的识别，同时避免在TAA缺失的情况下CD3在T细胞上的激活。一种被称为CrossMAb技术的创新设计平台能够以完整的IgG形式生成1：2价的双特异性抗体。Cibisatamab（又称CEA－TCB）是一种CrossMAb 形式的双抗，CD3和CEA的效价为1：2。Cibisatamab于2014年进入I期试验，目前正在表达CEA的实体瘤患者中进行研究（NCT02324257和NCT02650713）。

第一阶段的结果显示了很好的疗效并诱导出高度炎症性的TME。同时，至少有8种基于IgG的双特异性抗体已经使用CrossMAb技术进行开发，目前正在进行临床研究或处于临床前开发后期。其中抗CD20–CD3的REGN1979对NHL患者有良好的疗效。

抗癌免疫动员单克隆T细胞受体（ImmTACs）是一种新型的双功能抗体药物，结合了基于TCR的靶向系统和抗CD3单链抗体效应器功能。因此，这些分子可以将多克隆效应性T细胞重定向到肽－MHC复合物中呈现的TAAs或肿瘤特异性新抗原，包括来自细胞内蛋白质的抗原。通过利用可溶性高亲和力单克隆TCR结构域促进大量多克隆效应T细胞的招募，这类分子有潜力以现成的形式克服非炎性环境的TME。

Tebentafusp是第一个ImmTAC，靶向黑色素瘤相关抗原gp100与HLA－a＊02：01复合物呈递的多肽；这种药物已经在晚期葡萄膜黑色素瘤患者中显示出临床活性，并于2016年被FDA授予孤儿药资格，并于2019年获得快速通道资格。

小结

利用免疫系统的内在能量来靶向恶性细胞已经成为治疗各种癌症的一种既定模式。特别是，T细胞导向疗法，无论是基于抗体的BiTEs还是基于CAR－T的细胞疗法，在各种血液恶性肿瘤中都显示出了显著的疗效。blinatumomab的成功和正在进行的临床研究的结果表明了这种治疗方法的潜力。调节双特异性抗体的分子结构可以增强其抗肿瘤活性并减轻毒性。

正在进行的研究包括优化靶向TAAs的选择、通过给分子增加额外的效应器提高活性、及其调动其他类型免疫细胞的抗肿瘤活性。随着越来越多的双特异性抗体在临床试验中的研究，对针对特定肿瘤类型的最佳结构和对结构的理解也在增加。这些知识将有望提高T细胞导向疗法的抗肿瘤效果，预防疾病复发，并推动这一领域的未来发展。

参考文献：

1． T cell－engaging therapies － BiTEs and beyond． Nat Rev Clin Oncol． 2020 Jul；17（7）：418－434．

2． Quantitative Clinical Pharmacology of T－Cell Engaging Bispecifics： Current Perspectives and Opportunities． Clin Transl Sci． 2020 Sep 3．

3． T cell engaging bispecific antibody （T－BsAb）： From technology to therapeutics． Pharmacol Ther． 2018 Feb；182：161－175．